Actividad física y su relación con el sistema inmune / Physical activity and its relationship with the immune system

Introducción: El ejercicio mejora muchos aspectos de la salud humana, incluso, regula el sistema inmune. Se ha comprobado que el ejercicio moderado y regular ejerce efectos antiinflamatorios. Al mejorar las funciones inmunitarias, reduce la incidencia de enfermedades no transmisibles y la susceptibilidad a infecciones virales. Objetivo: Describir los efectos de la actividad física sobre el sistema inmune innato y adaptativo. Método: Para este manuscrito se usó la base de datos PubMed y Google Académico. Se utilizaron los términos ejercicios físicos, inmunidad, macrófago, neutrófilos, linfocitos e inmunoglobulinas, según el descriptor de Ciencias de la Salud. Se incluyeron 53 artículos en la revisión. Conclusiones: El ejercicio agudo (intensidad moderada a vigorosa, menos de 150 min) se considera un inmunoestimulante porque mejora la actividad antimicrobicida de los macrófagos e incrementa la síntesis de citocinas antiinflamatorias. Además, favorece el tráfico de neutrófilos, células NK, células T citotóxicas y células B inmaduras(AU)

Introduction: Exercise improves many aspects of human health, including, regulating the immune system. Moderate training has been shown to exert anti-inflammatory effects. By improving immune functions, it reduces the incidence of non-communicable diseases and susceptibility to viral infections. Objective: To describe the effects of physical activity on the innate and adaptive immune system. Methods: The PubMed and Google Scholar databases were used. The terms physical exercise, immunity, macrophage, neutrophils, lymphocytes and immunoglobulins were used, according to the Health Sciences descriptor (DeCS). Eighty-six articles were included in the review. Conclusions: Acute exercise (moderate to vigorous intensity, less than 150 min) is considered an immunostimulant because it enhances the antimicrobicidal activity of macrophages and increases the synthesis of anti-inflammatory cytokines. In addition, it favors the movement of neutrophils, NK cells, cytotoxic T cells and immature B cells(AU)

Análise dos mecanismos pró-inflamatórios do ácido úrico solúvel: efeito sobre proteínas sensíveis à modulação redox e sobre a polarização de células THP-1 / Analysis of the pro-inflammatory mechanisms of soluble uric acid: effect on redox sensitive proteins and THP-1 cell polarization

Vários estudos epidemiológicos estabelecem correlação positiva entre os níveis de ácido úrico sérico e o aumento do risco para doenças cardiovasculares. Fatores dietéticos e socioeconômicos, além da presença de comorbidades estão diretamente associados aos níveis séricos de ácido úrico. Países desenvolvidos apresentam maior incidência e prevalência da gota e alguns grupos étnicos são particularmente susceptíveis à hiperuricemia. Cristais de ácido úrico são descritos por iniciar e perpetuar resposta inflamatória, e sinalizar um padrão de resposta molecular associado ao dano (DAMP), permitindo a diferenciação de macrófagos para perfis pró-inflamatórios. Por outro lado, os efeitos do ácido úrico em sua forma solúvel ainda carecem de estudos. Macrófagos derivados de precursores monocíticos apresentam diferenciação específica e respondem a um conjunto de fatores extrínsecos, resultando em perfis distintos, um fenômeno conhecido como polarização. Assim, os macrófagos podem ser classicamente ativados para uma resposta Th1 (T helper 1) e polarizados a um perfil pró- inflamatório (M1, resposta Th1) ou a um perfil alternativo e oposto, um perfil de resolução da inflamação (M2, resposta Th2, T helper 2). Nesse sentindo, buscamos analisar os efeitos do ácido úrico solúvel sobre vias de modulação da polarização fenotípica de macrófagos e modificação redox. Utilizamos a linhagem monocítica humana THP-1, a qual foi diferenciada em macrófagossímile por acetato miristato de forbol (PMA; 5 ng.mL-1) por 48 h, seguidas da incubação com ácido úrico em meio ausente de tióis e soro fetal bovino por 8h ou 24h (0-1000 µM). A expressão de fatores de transcrição e marcadores de polarização foi realizada através de citometria de fluxo, western-blotting e por microscopia de fluorescência com alto conteúdo de imagens (HCI). Em concentrações fisiológicas, verificamos que o ácido úrico solúvel regulou positivamente a frequência de células para receptor manose CD206, um marcador clássico de perfil alternativo/M2 e regulou negativamente a expressão óxido nítrico sintase induzível (iNOS), um marcador M1, sugerindo inicialmente uma modulação para o perfil de polarização M2. Além disso, as proteínas redoxsensíveis, heme oxigenase-1 (HO-1) e tiorredoxina (Trx) tiveram sua expressão reduzida e aumentada, respectivamente, pelo tratamento com ácido úrico. Os fatores de transcrição Nrf2 e STAT3 tiveram regulação negativa após a exposição ao ácido úrico solúvel. Os resultados apresentados nesta tese sugerem uma função do urato no priming de macrófagos através da alteração da polarização destas células

Several epidemiological studies have established a positive correlation between high serum uric acid levels and increased risk for cardiovascular diseases. Developed countries have a higher incidence and prevalence of gout and some ethnic groups are particularly susceptible to hyperuricemia. Although hyperuricemia is a prevalent condition, it has still controversy biological consequences. Uric acid crystals are described as capable of initiating and perpetuating inflammatory responses, by activating the damage-associated molecular response pattern (DAMP) cascade, allowing macrophage differentiation to inflammatory profiles. In spite of that, biological response to soluble uric acid are not completely understood. Monocyte-derived macrophages respond to a set of extrinsic factors that result in different profiles and can be polarized to a proinflammatory (M1) or anti-inflammatory (M2) profile. In this thesis, we analyzed the effects of soluble uric acid on redox-modulated pathways and the phenotypic polarization of macrophages. We used human monocytic THP-1 cell line, differentiated into macrophage by phorbol myristate acetate (PMA; 5 ng.mL-1) for 48 h. After differentiation, cells were incubated with soluble uric acid in medium without thiols and fetal bovine serum for 8 h and 24 h (0-1000 µM). The expression of transcription factors and polarization markers were assessed by flow cytometry, western-blotting and fluorescence microscopy with high content imaging (HCI). At physiological concentrations, soluble uric acid positively regulated the frequency of cells for mannose receptor CD206, a classic marker of the anti-inflammatory M2 profile and negatively regulated the inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression, a proinflammatory M1 marker, suggesting that the soluble uric acid changes the polarization profile to M2 profile. In addition, the redox-sensitive proteins heme oxygenase-1 (HO-1) and thioredoxin (Trx) had their expression decreased and increased, respectively, after exposure to urate. STAT3 and Nrf2 transcription factors were downregulated upon soluble uric acid exposure. The results presented in this thesis suggest a role of uric acid in macrophage priming through the alteration of cell polarization

Proteinosis alveolar pulmonar / Pulmonary alveolar proteinosis

Resumen La proteinosis alveolar pulmonar (PAP) es una enfermedad pulmonar difusa, infrecuente, secundaria a una alteración en la homeostasis del surfactante. Se presenta el caso de una mujer de 69 años que ingresó a sala de internación por disnea progresiva hasta clase funcional III, de tres meses de evolución, asociada a tos no productiva. Se constató insuficiencia respiratoria tipo I. Como hallazgos en tomografía de tórax se evidenció engrosamiento del intersticio pulmonar intra e interlobulillar, opacidades en vidrio esmerilado y áreas con tendencia a la consolidación bilateral. Se realizó biopsia pulmonar con diagnóstico histológico de PAP y se efectuó tratamiento con lavado pulmonar total, logrando mejoría clínica. Se destaca la necesidad de tener presente diagnósticos diferenciales de insuficiencia respiratoria e infiltrados pulmonares en el contexto de la pandemia por COVID-19, incluidas las entidades muy poco prevalentes como lo es la PAP.

Abstract Pulmonary alveolar proteinosis (PAP) is a rare, diffuse pulmonary disease due to abnormal surfactant homeostasis. We present the case of a 69-year-old woman who was admitted to the hospital for progressive dyspnea with marked limitation in activity, and non-productive cough, of three months of evolution. Type I respiratory failure was confirmed. Chest tomography findings were interlobular and intralobular septal thickening, ground glass opacities and bilateral consolidation. Histological diagnosis was made and whole-lung lavage was performed with clinical improvement. We highlight the need to keep in mind differential diagnoses of respiratory failure and pulmonary infiltrates during COVID-19 pandemic, even rare entities such as PAP.

Apamin-induced alterations in J774 1. 6 macrophage metabolism / [Alterações induzidas por apamina no metabolismo de macrófagos J774 1. 6]

Among the immune system cells, macrophages have an important role. Apamin, a bee venom constituent, is important in the defense of these insects. Thus, we aimed to evaluate the metabolism of J774 1.6 macrophage cell line when exposed to isolated and purified apamin, using cytotoxicity tests by MTT reduction and analysis by flow cytometry (apoptosis / necrosis, production of reactive oxygen species (ROS), membranous lipoperoxidation (LPO), electrical potential of the mitochondrial membrane (mMP) and DNA fragmentation). None of the tested concentrations (10 to 100µg/mL) were cytotoxic according to MTT reductions. Apoptosis rates decreased at concentrations of 2.5, 5.0, and 10.0µg/mL (P<0.05), while necrosis rates increased (P<0.05). However, rates of healthy cells at the highest tested concentration (10µg/mL) did not differ from control (P>0.05). Apamin did not alter ROS, LPO, or DNA fragmentation. Therefore, all analyzed concentrations (1.25 to 10µg/mL) decreased mMP. Such decrease in apoptosis might be due to a suppression of mitochondrial pro-apoptotic messengers, as this peptide causes no oxidative stress, lipid peroxidation, and DNA damage. Highly sensitive techniques are majorly important for proper interpretation of cellular toxicity mechanisms, combined with routine laboratory methods.(AU)

Das células do sistema imunológico, macrófagos desempenham um papel fundamental. Apamina, constituinte do veneno de abelhas, é importante na defesa destas. Objetivou-se avaliar o metabolismo da linhagem de macrófagos J774 1.6 expostos à apamina isolada e purificada, avaliando-se citotoxicidade por redução de MTT e análise por citometria de fluxo (apoptose / necrose, produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), lipoperoxidação membranosa (LPO), potencial elétrico da membrana mitocondrial (MMP) e fragmentação do DNA). Nenhuma concentração testada (10 a 100µg / mL) foi citotóxica. As taxas de apoptose diminuíram nas concentrações 2,5, 5,0 e 10,0µg / mL (P<0,05), enquanto as de necrose aumentaram (P<0,05). Entretanto, as taxas de células saudáveis na maior concentração testada (10µg / mL) não diferiram do controle (P>0,05). A apamina não alterou as ERO, a LPO nem a fragmentação do DNA. Portanto, todas as concentrações analisadas (1,25 a 10µg / mL) diminuíram a mMP. Tal diminuição na apoptose pode ser por uma supressão de mensageiros pró-apoptóticos mitocondriais, já que este peptídeo não causa estresse oxidativo, peroxidação lipídica nem dano ao DNA. Técnicas altamente sensíveis são importantes para adequada interpretação dos mecanismos de citotoxicidade.(AU)

Evaluation of cell damage and modulation of cytokines TNF-α, IL-6 and IL-10 in macrophages exposed to PpIX-mediated photodynamic therapy / Avaliação do dano celular e da modulação das citocinas TNF-α, IL-6 e IL-10 em macrófagos expostos à terapia fotodinâmica mediada pela PpIX

Abstract Little is known regarding whether photodynamic therapy (PDT)-induced cell death can substantially compromise macrophages (MΦ), which are important cells in PDT-induced immune responses. Here, parameters of PDT-mediated MΦ cytotoxicity and cytokine production in response to protoporphyrin IX (PpIX) were evaluated. Peritoneal MΦ from BALB/c mice were stimulated in vitro with PDT, light, PpIX, or lipopolysaccharide (LPS). After that, cell viability, lipid peroxidation, Nitric Oxide (NO), DNA damage, TNF-α, IL-6 and IL-10 were evaluated. Short PDT exposure reduced cell viability by 10-30%. There was a two-fold increase in NO and DNA degradation, despite the non-increase in lipoperoxidation. PDT increased TNF-α and IL-10, particularly in the presence of LPS, and decreased the production of IL-6 to 10-fold. PDT causes cellular stress, induces NO radicals and leads to DNA degradation, generating a cytotoxic microenvironment. Furthermore, PDT modulates pro- and anti-inflammatory cytokines in MΦ.

Resumo Pouco se sabe se a morte celular induzida pela terapia fotodinâmica (PDT) compromete os macrófagos (MΦ), envolvidos nas respostas imunes induzidas pela PDT. Neste estudo, foram avaliados parâmetros de citotoxicidade dos MΦ mediada pela PDT e a produção de citocinas, frente à protoporfirina IX (PpIX). MΦ peritoneais de camundongos BALB/c foram estimulados in vitro com PDT, luz, PpIX ou lipopolissacarídeo (LPS). Após isto, a viabilidade celular (VC), a lipoperoxidação, os níveis de óxido nítrico (NO), de DNA degradado, de TNF-α, IL-6 e IL-10 foram avaliados. A exposição curta à PDT reduziu a VC em 10-30%. Os níveis de NO e de DNA degradado duplicaram, sem aumento da lipoperoxidação. Houve aumento de TNF-α e IL-10, sendo maior na presença de LPS. Já a produção de IL-6 reduziu em dez vezes. A PDT induz estresse celular, gera radicais NO e causa dano ao DNA, tornando o microambiente citotóxico. Ainda, modula citocinas pró e anti-inflamatórias em MΦ.

Efecto Regulador de Tibolona sobre la Actividad Antiinflamatoria del Macrófago / Regulatory Effect of Tibolone on Antiinflamatory Activity of Macrophage

Resumen Los macrófagos son células fagocíticas que activan a la sintasa de óxido nítrico (SON) y la NADPH oxidasa con el objetivo de eliminar agentes que reconocen como extraños. Además, participan en el desarrollo y mantenimiento de la respuesta inflamatoria. Tibolona (Tb), a través de sus metabolitos, tiene actividad estrogénica, progestagénica y androgénica. Es utilizada como alternativa de la terapia hormonal de la menopausia, que además disminuye marcadores de inflamación. El objetivo de este estudio fue describir el efecto de Tb sobre la expresión de las interleucinas I, 6, 10 y TNF-α así como la actividad de la NADPH oxidasa del macrófago. Se utilizó la línea celular THP-1, se diferenció a macrófago, y se evaluó la actividad de NADPH oxidasa por el ensayo de NBT y la expresión de IL-1β, IL-6, TNF-α e IL-10 por RT-qPCR. Se encontró que Tb regula la actividad enzimática, así como la expresión de citocinas ante un estímulo proinflamatorio. Por lo que se concluye que Tb favorece la actividad antiinflamatoria del macrófago. Estos resultados contribuyen a la descripción de los mecanismos de acción de este fármaco. Además, se propone al macrófago como un blanco de regulación del proceso inflamatorio por acción de Tb. Se sugiere que se determine la expresión proteica de las citocinas por otras técnicas, tales como western blot, ELISA, o citometría de flujo; así como la actividad de SON.

Abstract Macrophages are phagocytic cells that activate NOS and NADPH oxidase to eliminate agents that recognize like strangers, also participate in development and maintain of inflammatory response. In other hand, tibolone (Tb) has three main metabolites, which have an estrogenic, prostagenic and androgenic activity. This drug is a hormonal therapy to treat symptoms of menopause, with ability to decrease inflammation markers. The aim of this study is to describe the effect of Tb on macrophage activity. This study was carried out on differentiated macrophage THP-1 cell line used. NADPH oxidase activity by NBT assay and expression of IL-1β, IL-6, TNF-α and IL-10 by RT-qPCR were measured. It has been observed that Tb regulates the enzymatic activity, as well as the cytokines expression in the cells that received a proinflammatory stimulus; these results contribute to description of mechanism of action of this drug. The results suggest that macrophage could be a target for antiinflammatory action of Tb. Its remain to investagate the protein expression of cytokines and activity of iNOS.

Increased leishmanicidal activity of alveolar macrophages from mature horses with mild equine asthma / Aumento da atividade leishmanicida de macrófagos alveolares de equinos adultos com asma equina leve

Alveolar macrophages (AMs) are an essential part of defense mechanisms within the lungs and their phagocytic activity is important for organ homeostasis. The phagocytic ability of AMs obtained from bronchoalveolar lavage from 17 mature mixed-breed pleasure horses (8 healthy and 9 diagnosed with mild equine asthma) was studied through assays with Leishmania (Viannia) braziliensis promastigotes, which enabled the calculation of a phagocytic index (PI) and a survival index (SI). Results indicate that phagocytic activity of AMs in asthma affected horses is similar to healthy horses, while leishmanicidal activity is significantly increased in horses with asthma.(AU)

Os macrófagos alveolares (MAs) são uma parte essencial dos mecanismos de defesa dentro dos pulmões e sua atividade fagocítica é importante para a homeostase desse órgão. A capacidade fagocitária dos MAs obtidos do lavado broncoalveolar de 17 equinos adultos, sem raça definida (oito saudáveis e nove com diagnóstico de asma equina leve), foi estudada por meio de ensaios com promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis. Foi calculado o índice fagocítico e o índice de sobrevivência. Os resultados indicam que a atividade fagocítica de MAs em cavalos com asma é semelhante a cavalos saudáveis, enquanto a atividade leishmanicida está significativamente aumentada em cavalos com essa enfermidade.(AU)

Inmunopatología de la brucelosis osteoarticular / Immunopathology of osteoarticular brucelosis

La brucelosis es una de las enfermedades zoonóticas más importantes a nivel mundial capaz de producir enfermedad crónica en los seres humanos. La localización osteoarticular es la presentación más común de la enfermedad activa en el hombre. Sin embargo, algunos de los mecanismos moleculares implicados en la enfermedad osteoarticular han comenzado a dilucidarse recientemente. Brucella abortus induce daño óseo a través de diversos mecanismos en los cuales están implicados TNF-α y RANKL. En estos procesos participan células inflamatorias que incluyen monocitos/macrófagos, neutrófilos, linfocitos T del tipo Th17 y linfocitos B. Además, B. abortus puede afectar directamente las células osteoarticulares. La bacteria inhibe la deposición de la matriz ósea por los osteoblastos y modifica el fenotipo de estas células para producir metaloproteinasas de matriz (MMPs) y la secreción de citoquinas que contribuyen a la degradación del hueso. Por otro lado, la infección por B. abortus induce un aumento en la osteoclastogénesis, lo que aumenta la resorción de la matriz ósea orgánica y mineral y contribuye al daño óseo. Dado que la patología inducida por Brucella afecta el tejido articular, se estudió el efecto de la infección sobre los sinoviocitos. Estos estudios revelaron que, además de inducir la activación de estas células para secretar quemoquinas, citoquinas proinflamatorias y MMPs, la infección inhibe la muerte por apoptosis de los sinoviocitos. Brucella es una bacteria intracelular que se replica en el retículo endoplásmico de los macrófagos. El análisis de los sinoviocitos infectados con B. abortus indicó que las bacterias también se multiplican en el retículo endoplasmático, lo que sugiere que la bacteria podría usar este tipo celular para la multiplicación intracelular durante la localización osteoarticular de la enfermedad. Los hallazgos presentados en esta revisión intentan responder a preguntas sobre los mediadores inflamatorios implicados en el daño osteoarticular causado por Brucella. (AU)

Brucellosis is one of the most important zoonotic diseases that can produce chronic disease in humans worldwide. Osteoarticular involvement is the most common presentation of human active disease. The molecular mechanisms implicated in bone damage have started to be elucidated. B. abortus induces bone damage through diverse mechanisms in which TNF-α and RANKL are implicated. These processes are driven by inflammatory cells, including monocytes/macrophages, neutrophils, Th17 lymphocytes and B cells. Also, Brucella abortus (B. abortus) can directly affect osteoarticular cells. The bacterium inhibits bone matrix deposition by osteoblast and modifies the phenotype of these cells to produce matrix methalloproteinases (MMPs) and cytokine secretion that contribute to bone matrix degradation. B. abortus also affects osteoclast increasing mineral and organic bone matrix resorption and contributing to bone damage. Since the pathology induced by Brucella species involves joint tissue, experiments conducted in sinoviocytes revealed that besides inducing the activation of these cells to secrete chemokines, proinflammatory cytokines and MMPS, the infection also inhibits sinoviocyte apoptosis. Brucella is an intracellular bacterium that replicate in the endoplasmic reticulum of macrophages. The analysis of B. abortus infected sinoviocytes indicated that bacteria also replicate in their reticulum suggesting that the bacterium could use this cell type for intracellular replication during the osteoarticular localization of the disease. The findings presented in this review try to answer key questions about the inflammatory mediators involved in osteoarticular damage caused by Brucella. (AU)

Efeito da Migalina sobre atividade inflamatória com diferentes estímulos em linhagens de macrófagos J774 e derivados de medula óssea

Natural polyamines putrescine, spermine and spermidine are essential for cell growth and proliferation, protein and nucleic acid synthesis, cell matrix repair, adhesion and signaling processes. Mygalin was isolated from hemocytes of the spider Acanthoscurria gomesiana and identified as a bis-acylpolyamine analogue to spermidine, possessing microbicidal activity. Macrophages are innate immune response cells fundamental in the inflammatory process and are programmed to detect molecular patterns associated with pathogens. Immune cell surface molecules and cytokines are the key components for the achievement of the inflammatory response. Due to the limited knowledge of the role of Mygalin in the immune response, we investigated its immunomodulatory function in macrophages J774 and macrophages derived from C57BL / 6 mouse marrow MODM against several stimuli in different assays. The cells were either preincubated with Mygalin 40-160 μg/ml for 2 hours prior to stimulation or not with LPS 100 ng/ml, Toxoplasma gondii antigen 10-25-50 μg/ml, IFN-γ 1 ng/ml and Zimosan 10 μg/ml After 24 hours, hydrogen peroxide production was examined by the fluorimetric method with and without PMA (200 nM) and the alteration of the expression of the surface molecules by flow cytometry FACS. Supernatants from the J774 and MODM assays were harvested for quantify production of IL-12p40 ELISAand nitrite Griess. Treatment of cells with Mygalin and Toxoplasma gondii didn’t induce IL-12p40 and NO production. In J774 IFN-γ didn’t change the amount of NO in the control, but the LPS increased even in the presence of Mygalin and the same happened with LPS+IFN-γ. Zimosan increased NO production in J774, but IFN- γ reduced it. In MODM independent of the stimulus there was no alteration of the NO synthesis compared to control. Mygalin didn’t increase the production of IL-12p40 when the cells were stimulated by LPS and LPS+IFN-γ. Zimosan induced the synthesis of IL-12p40, but with IFN-γ the production reduced. We evaluated the effect of Mygalin on the production of hydrogen peroxide in MODM that Migalina reduced H2O2 production in the presence of PMA. Regarding the expression of CD11b: in J774 the LPS and LPS+IFN-γ decreased expression; F4 / 80: in MODM the LPS increased its synthesis; CD86: in J774 the LPS decreased expression even with IFN-γ, and in MODMall stimuli reduced synthesis even with Mygalin; CD284: no change in J774cells; CD206: LPS and LPS+IFN-γ there was a slight increase of the synthesis.The mechanisms involved are being analyzed for a better characterization ofthe role of macrolide in the macrophage.

Poliaminas naturais (putrescina, espermina e espermidina) são fundamentais para o crescimento e proliferação celular, na síntese de proteínas e de ácidos nucleicos, reparação da matriz celular, adesão e processos de sinalização. A Migalina foi isolada de hemócitos da aranha Acanthoscurria gomesiana e identificada como uma bis-acilpoliamina análoga a espermidina, possuindo atividade microbicida. Macrófagos são células da resposta imune inata fundamentais no processo inflamatório e são programadas para detectar padrões moleculares associados a patógenos. Moléculas de superfície de células imunes e as citocinas são componentes fundamentais para a realização da resposta inflamatória. Devido ao limitado conhecimento do papel da Migalina na resposta imune investigamos sua função imunomoduladora em macrófagos J774 e macrófagos derivados de medula de camundongo C57BL/6 (MODM) frente a vários estímulos em diferentes ensaios. As células foram pré- incubadas ou não com Migalina (40-160 μg/mL) por 2 horas antes da estimulação ou não com LPS (100 ng/mL), antígeno de Toxoplasma gondii (10- 25-50 μg/mL), IFN-γ (1 ng/mL) e Zimosan (10 μg/mL). Após 24 horas, a produção de peróxido de hidrogênio foi examinada pelo método fluorimétrico com e sem PMA (200 nM) e a alteração da expressão de moléculas de superfície por meio de citometria de fluxo (FACS). Os sobrenadantes dos ensaios de J774 e MODM foram colhidos para análises de IL-12p40 (ELISA) e nitrito (Griess). O tratamento das células com Migalina e Toxoplasma gondii não induziu a produção IL-12p40 e de NO. Em J774 o IFN-γ não alterou a quantidade de NO do controle, mas o LPS aumentou mesmo na presença de Migalina e o mesmo ocorreu com LPS+IFN-γ. O Zimosan aumentou a produção de NO em J774, mas o IFN-γ a reduziu. Em MODM independente do estímulo não houve alteração da síntese de NO comparado ao controle. A Migalina não aumentou a produção de IL-12p40 quando as células foram estimuladas com LPS e LPS+IFN-γ. Zimosan induziu a síntese de IL-12p40, mas na presença de IFN-γ a produção reduziu. Avaliamos o efeito da Migalina na produção de peróxido de hidrogênio em MODM no qual a Migalina reduziu a produção de H2O2 na presença de PMA. Com relação à expressão de CD11b: em J774 o LPS e LPS+IFN-γ diminuiu a expressão; F4/80: em MODM LPS aumentou sua síntese; CD86: em J774 LPS diminuiu a expressão mesmo com IFN-γ e em MODM todos os estímulos reduziu a síntese mesmo com Migalina; CD284: sem alteração nas células J774; CD206: LPS e LPS+IFN-γ houve um leve aumento da síntese. Os mecanismos envolvidos estão sendo analisados para melhor caracterização do papel da Migalina em macrófagos.

Avaliação da resposta de macrófagos inflamatórios frente aos cimentos biocerâmico / Evaluation of the inflammatory macrophagus response in front of bioceramic cements

As propriedades e a composição dos cimentos endodônticos podem influenciar nas reações inflamatórias perirradiculares e comprometer o sucesso do tratamento endodôntico. Os macrófagos estão presentes no infiltrado inflamatório periapical, envolvidos na eliminação e controle microbiano nesta região. Este estudo avaliou a atividade de viabilidade celular, aderência, fagocitose da levedura S. boulardii, produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), óxido nítrico (NO), e das citocinas (TNF- α e TGF-ß) por macrófagos peritoneais murinos de perfil pró-inflamatório (M1) e anti-inflamatório (M2) obtidos de camundongos C57BL/6 e BALB/c, respectivamente. Os macrófagos foram obtidos e a suspensão celular foi colocada em contato com capilares contendo ou não os cimentos Endosequence BC Sealer (BC), Sealer PLus BC (MK), Bio-c Sealer (Ang) e MTA. Mensurou-se a viabilidade celular pelos métodos da exclusão do azul de tripan e por MTT nos tempos 24, 48 e 72 horas. No primeiro ensaio, foi encontrada viabilidade celular semelhante entre os biocerâmicos e o MTA nos tempos testados; no entanto, houve diferença significativa em 72h entre BC e controle (capilar vazio); para o MTT houve diferença com o controle entre: Ang (24h), BC e MK (48h) para M1; para M2, MK (24h), Ang (48h) e BC, Ang, MTA (72h) (p<0,05). Nos ensaios de aderência e de fagocitose não houve diferença significativa para os materiais testados em ambos os subtipos de macrófago. Em relação à produção de ROS, houve uma maior expressão para M1 em comparação com M2. Na ausência do Zimosan não houve produção significativa entre os cimentos, para ambos os macrófagos. Na presença do Zimosan A, o cimento MK apresentou maior produção que os grupos tratados com Ang e MTA, e controle (p<0,05) para macrófago M1. No ensaio de detecção de NO, na presença do estímulo, todos os cimentos testados apresentaram diferenças significativas com o controle, para o macrófago M1. Na dosagem de TNF houve diferença significativa somente para macrófagos M1, com uma maior produção pelo cimento Endosequence BC, mesmo sem estímulo; sobretudo, quando estimulados com IFN-γ, BC apresentou maior produção que os grupos tratados MK e Ang; e, todos os grupos apresentaram diferenças em relação ao controle. A dosagem de TGF- ß não apresentou diferenças para os grupos tratados na presença ou ausência do estímulo. Concluiu-se que a composição dos biocerâmicos, à base de silicato de cálcio, semelhante à do MTA, permitiu que os biocerâmicos não interferissem nas respostas de macrófagos de ambas as linhagens testadas.

The properties and compositions of endodontic sealers may influence the periradicular inflammatory reactions and compromise the success of endodontic treatment. Macrophages are present in the periapical inflammatory infiltrate, being involved in the microbial clearance in this region. This study evaluated the cell viability, adhesion, phagocytosis of S. boulardii, production of reactive oxigen species (ROS) and nitrite oxide (NO) and cytokines (TNF and TGF-ß) by murine peritoneal macrophages of pro-inflammatory (M1) and anti-inflammatory (M2) profiles obtained from C57BL / 6 and BALB / c mice, respectively. Macrophages were obtained and the cell suspension was placed in contact with capillaries containing or not the sealers Endosequence BC Sealer (BC), Sealer PLus BC (MK), Bio-c Sealer (Ang) e MTA. Cell viability was measured by the methods of tripan blue exclusion and by MTT at times 24, 48 and 72 hours. In the first assay, similar cell viability was found between the bioceramic and the MTA in the tested times; However, there was a significant difference in 72h between BC and control (empty capillary); For the MTT there was a difference with the control between: Ang (24h), BC e MK (48h) para M1; para M2, MK (24h), Ang (48h) e BC, Ang, MTA (72h) (p<0,05). n the adherence and phagocytosis assays there was no significant difference for the materials tested in both macrophage subtypes. Regarding the production of ROS, there was a greater expression for M1 compared to M2. In the absence of Zymosan there was no significant production between the sealers for both macrophages. In the presence of Zimosan A, the MK cement presented higher production than the groups treated with Ang and MTA, and control (p <0.05) for M1 macrophages. n the NO detection assay, in the presence of the stimulus, all the sealers tested showed significant differences with the control, for the M1 macrophage. In the TNF there was only difference for M1, with a higher production by the Endosequence BC even without stimulus, when stimulated with IFN-γ, BC showed higher production than the treated groups MK and Ang; and all groups showed differences in relation to control. The TGF-ß dosage did not present difference for the groups treated in the presence or absence of the stimulus. It was concluded that the calcium silicate composition, similar to that of MTA, allowed the bioceramics to not interfere in the macrophages responses of both tested strains.

Experimental poisoning by Brachiaria decumbens in rabbits / Intoxicação experimental por Brachiaria decumbens em coelhos

Brachiaria spp. are important sources of forage for ruminants in Brazil, due to the easy cultivation, good resistance to drought, good adaptation to different soils and low maintenance cost. However, the ingestion of this grass has been related to photosensitization outbreaks in cattle and sheep with significant economic losses. The hepatotoxic effects related to the ingestion of grass are the formation of crystals and foamy macrophages due to the accumulation of toxic metabolites. The use of cattle and sheep in experiments involving the plant presents several obstacles in the ethical, economic and animal management. The objective of this study was to evaluate the sensitivity of rabbits as an experimental model for B. decumbens poisoning. Two experiments were carried out. In Experiment 1 four rabbits received the fresh plant in daily doses of 10, 20, 40 and 80g/kg body weight for 120 days. In Experiment 2 three rabbits received the fresh plant in amounts of 500g daily with duration of 210 days. The animals of Experiment 1 showed no clinical signs and no macroscopic and microscopic changes characteristic of B. decumbens poisoning. In Experiment 2 the animals also showed no clinical signs or significant macroscopic alterations. Histological analysis showed isolated foamy macrophages or present in random groups of cells in the liver and mesenteric lymph nodes. Samples of liver and mesenteric lymph nodes of the rabbits of Experiment 2 were submitted to the lectin-histochemistry technique. The WGA, sWGA and RCA lectins showed reactivity in foamy macrophages in both organs. This is the first study of our knowledge that demonstrates histopathological lesions caused expetimentally by Brachiaria spp. in rabbits, demonstrating its potential as an animal model.(AU)

Brachiaria ssp. são importantes fontes de forragem para ruminantes no Brasil, devido ao fácil cultivo, boa resistência a seca, boa adaptação a diferentes solos e baixo custo de manutenção. Entretanto, a ingestão desta gramínea está relacionada a surtos de fotossensibilização, em bovinos e ovinos, principalmente, ocasionando prejuízos econômicos significativos. Os efeitos hepatotóxicos relacionados à ingestão da gramínea são a formação de cristais e macrófagos espumosos causados pelo acúmulo de metabólitos tóxicos. A utilização de bovinos e ovinos em experimentos envolvendo a planta apresenta vários empecilhos, tanto no âmbito ético, econômico e no manejo dos animais. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a sensibilidade de coelhos como modelo experimental para intoxicação por B. decumbens. No presente estudo foram realizados dois experimentos. O Experimento 1 utilizou quatro coelhos que receberam a planta fresca em doses diárias de 10, 20, 40 e 80 g/Kg de peso vivo durante 120 dias. O Experimento 2 utilizou três coelhos recebendo a planta fresca em quantidades de 500g diárias por animal com duração de 210 dias. No Experimento 1, os animais não apresentaram sinais clínicos e nem alterações macroscópicas e microscópicas características de intoxicação por B. decumbens. No Experimento 2 os animais também não apresentaram sinais clínicos e alterações macroscópicas significativas. Na análise histológica observou-se presença de macrófagos espumosos isolados ou em grupos aleatórios de células no fígado e nos linfonodos mesentéricos. Amostras de fígado e linfonodos mesentéricos dos animais do Experimento 2 foram submetidos à técnica de lectino-histoquímica. As lectinas WGA, sWGA e RCA apresentaram reatividade em macrófagos espumosos nos dois órgãos. Este é o primeiro trabalho de nosso conhecimento que demonstra lesões histopatológicas por Brachiaria spp conduzido de forma experimental em coelhos, demonstrando seu potencial como modelo animal nesse campo de estudo.(AU)

Assessment of the oxidative metabolism of calves' bronchoalveolar cells: comparison between NBT and fluorimetric techniques / Mensuração do metabolismo oxidativo de células broncoalveolares de bezerros: comparação entre as técnicas de NBT e fluorimétrica

Evaluation of alveolar macrophage functions of cattle is an important tool in order to assess whether measures taken during the cattle husbandry can decrease the respiratory tract defense. The aim of this study was to determine whether dexamethasone used at therapeutic dose can affect the oxidative metabolism of alveolar macrophages of cattle. This was evaluated by two tests, the fluorometric and colorimetric. The similarity of the results was studied, using alveolar macrophages of six healthy cattle, obtained from bronchoalveolar lavage on a basal and an immunosuppressant moment after the application of dexamethasone. For the fluorometric test, alveolar macrophages were incubated with Staphylococcus aureus and 2'-7'dichlorohidroflurescein, and analyzed by flow cytometer. For the colorimetric test, alveolar macrophages were incubated with Phorbol 12- miristate-13 acetate and nitroblue tetrazolium, dissolved and analyzed in a spectrophotometer. It was noted that dexamethasone therapeutic dose (0.05 mg/kg) reduced the functions of alveolar macrophages from healthy bovine. This result was observed by both tests with the difference that the flow cytometry assay was more informative for identifying which specific cellular function has been compromised.(AU)

A avaliação das funções de macrófagos alveolares de bovinos é uma ferramenta importante no intuito de analisar se medidas adotadas durante a criação desses animais diminuem a defesa do trato respiratório, aumentando a susceptibilidade à pneumonia. O objetivo deste trabalho foi verificar se a dexametasona em dose terapêutica afeta o metabolismo oxidativo de macrófagos alveolares de bovinos por meio de duas provas, a fluorimétrica e a colorimétrica, avaliando a similaridade dos resultados. Para tanto, utilizaram-se macrófagos alveolares de seis bovinos sadios, obtidos por meio de lavados broncoalveolares em um momento basal e em um momento imunossupressor, após a aplicação da dexametasona. Na prova fluorimétrica, os macrófagos alveolares foram incubados com Staphylococcus aureus e o fluorófilo 2'-7' diclorohidrofluresceína e analisados por citometria de fluxo. Na prova colorimétrica, os macrófagos alveolares foram incubados com Phorbol 12- miristate-13 acetate e nitroazul de tetrazolium, dissolvidos e analisados em espectofotômetro. Observou-se que a dexametasona em dose terapêutica (0,05 mg/kg) reduziu as funções dos macrófagos alveolares de bovinos sadios, sendo este resultado obtido em ambas as provas, com a diferença de que o teste de citometria de fluxo foi mais esclarecedor por identificar qual função celular específica foi comprometida.(AU)

Estudo da contribuição da autofagia para a susceptibilidade por L. Amazonensis ou resistência por L. Major na infecção de macrófagos murinos da linhagem CBA / Study of the contribution of autophagy to susceptibility by L. Amazonensis or resistance by L. Major in the infection of murine macrophages of the CBA

INTRODUÇÃO: Macrófagos de camundongos CBA controlam a infecção por Leishmania major, no entanto, são permissivos à infecção por Leishmania amazonensis. Os estudos conduzidos, até o momento, sobre o papel desempenhado pela autofagia na infecção por Leishmania levaram a dados controversos. OBJETIVO: No presente trabalho, avaliamos se a resposta autofágica de macrófagos infectados pode ser responsável pela diferença no curso da infecção por essas duas espécies de Leishmania. MATERIAL e MÉTODOS e RESULTADOS: Inicialmente, demonstramos por qPCR e por análise de dados de microarranjos públicos que um número maior de genes relacionados à autofagia é modulado positivamente em células infectadas por L. amazonensis em comparação às infectadas L. major. Ingenuity Pathway Analysis (IPA) demonstrou modulação oposta dos genes relacionados à autofagia entre os macrófagos infectados com L. amazonensis daqueles infectados com L. major. Após 24 h de infecção, a relação LC3-II/Act é aumentada tanto em macrófagos infectados por L. amazonensis quanto nos infectados por L. major em comparação com controles não infectados, mas menos do que em células tratadas com cloroquina. Embora, os vacúolos parasitóforos induzidos por L. major tenham apresentado maior positividade para o marcador degradativo, DQBSA, o recrutamento de LC3 foi maior nos vacúolos parasitóforos induzidos por L. amazonensis. Interessantemente, tanto a indução farmacológica quanto a fisiológica da autofagia aumentaram a viabilidade intracelular de L. amazonensis e L. major, enquanto a inibição da autofagia não teve efeito sobre a viabilidade intracelular desses parasitas. Também demonstramos que a indução da autofagia reduziu a produção de NO por macrófagos infectados por L. amazonensis ou L. major, mas não alterou a atividade da arginase, A análise de componentes principais e agrupamento hierárquico de clusters discriminaram completamente os macrófagos infectados por L. major de células infectadas por L. amazonensis de acordo com a intensidade da infecção e características autofágicas dos vacúolos induzidos por essas duas cepas. CONCLUSÃO: Em conclusão, a infecção por L. amazonensis ou L. major, apesar de ativar similarmente o fluxo autofágico em macrófagos infectados e os parasitos terem sua viabilidade favorecida pela indução da autofagia, promove expressão diferenciada de genes relacionados à autofagia e interação distinta dos vacúolos parasitóforos com compartimentos autofágicos. Essas diferenças são capazes de separar completamente os macrófagos infectados por L. amazonensis daqueles por L. major

INTRODUCTION: CBA mouse macrophages (MΦ) control Leishmania major infection yet are permissive to Leishmania amazonensis. The role played by autophagy in Leishmania infection needs further investigation. OBJECTIVE: Thus, we assessed whether activation of autophagic pathway may account for differences in the response of infected MΦ to these two parasite strains. MATERIAL and METHODS and RESULTS: First, we demonstrated by qPCR and by analysis of publicly available microarray data that a greater number of autophagy-related genes (Atg) are positively modulated in cells infected by L. amazonensis compared to those infected by L. major. Ingenuity Pathway Analyses (IPA) demonstrated opposite modulation in genes in L. amazonensisand L. major-infected MΦ. After 24 h of infection, the autophagic flux measured by LC3-II/Act ratio was similarly increased in either L. amazonensis- or L. majorinfected MΦ compared to uninfected cells. Although L. major-induced parasitophorous vacuoles exhibited greater positivity for the degradative marker, DQ-BSA, LC3 recruitment was increased in L. amazonensis-induced parasitophorous vacuoles. Interestingly, autophagy induction enhanced intracellular L. amazonensis and L. major viability, although autophagy inhibition caused no effect on infection profile. We also demonstrated that autophagy induction reduced NO production by Leishmania-infected MΦ, yet did not alter arginase activity. Moreover, principal component analysis completely discriminated L. major-infected MΦ from L. amazonensis-infected cells regarding infection intensity and autophagic features of parasite-induced PV. CONCLUSION: In conclusion, infection by L. amazonensis or L. major, although similarly activates the autophagic flux in infected MΦ and the parasites have their viability favored by autophagy induction, these Leishmania species cause differentiated expression of Atg and distinct interaction of their parasitophorous vacuoles with autophagic vacuoles. These differences are capable to discriminate MΦ infected by L. amazonensis from those infected by L. major

Modelo macrófago humano-amastigote para la identificación de aislados quimio-resistentes de leishmania, prueba de concepto / A human macrophage-amastigote model for chemo-resistant isolates identification in Leishmania, a proof of concept

Este trabajo utilizó un modelo macrófago humano-amastigote como herramienta para recrear in vitro la infección causada por aislados de pacientes con fracaso terapéutico y valorar su utilidad en la identificación de aislados de Leishmania con fenotipo quimio-resistente. Objetivos: (1) Evaluar un modelo in vitro de macrófago humano-amastigote y (2) Determinar su utilidad en la identificación de aislados de Leishmania con fenotipo quimio-resistente. Métodos: Se evaluó un protocolo de purificación basado en la capacidad de los monocitos de adherirse al plástico. Monocitos purificados de sangre humana fueron infectados con promastigotes metacíclicos de especies de referencia y aislados de Leishmania de tres pacientes con falla terapéutica a antimoniales. Se determinó el porcentaje de infección inicial y el efecto leishmanicida de glucantime, anfotericina­B y pentamidina; se correlacionó la capacidad leishmanicida con los niveles de producción de óxido nítrico en cada condición estudiada. Resultados: Los resultados sugieren que el modelo macrófago humano-amastigote empleado recrea in vitro la infección causada por especies de referencia, o con aislados de pacientes con fracaso terapéutico. Adicionalmente sugieren que en monocitos infectados (1) con el aislado VE98MR no puede definirse una IC50 para glucantime ni para pentamidina y (2) con el aislado VE96ZC no puede definirse una IC50 para glucantime mas si para pentamidina. De igual forma, se evidencia una disminución efectiva del porcentaje de infección susceptible a anfotericina-B, para todos los aislados y cepas de referencia. El efecto leishmanicida no se correlaciona con aumentos significativos de la producción de óxido nítrico. Conclusiones: El modelo macrófago humano-amastigote empleado constituye una prueba de concepto que permitió identificar como aislados potencialmente quimio-resistentes a L. (L.) amazonensis (VE98MR) y L. (L.) mexicana (VE96ZC), mas no al aislado L. (L.) amazonensis (VE2000MM)(AU)

This work used a human-amastigote macrophage model as a tool to recreate in vitro infection caused by isolates from patient's with therapeutic failure and assess its usefulness in the identification of chemo-resistant Leishmania isolates. Objectives: (1) Evaluate in vitro a human-amastigote macrophage model and (2) determine its usefulness in the identification of Leishmania isolates with chemo-resistant phenotype. Methods: A purification protocol based on the ability of monocytes to adhere to plastic was evaluated. Monocytes purified from human blood were infected with metacyclic promastigotes of reference species and Leishmania isolates from three patients with antimonial therapeutic failure. The percentage of initial infection and the leishmanicidal effect of glucantime, amphotericin-B and pentamidine were determined; the leishmanicidal capacity was correlated with the levels of nitric oxide production in each condition studied. Results: Results suggest that the human-amastigote macrophage model recreates in vitro the infection caused by reference species, or isolates from patients with therapeutic failure. In addition, they suggest that (1) an effective IC50 for glucantime and pentamidine could not be defined in monocytes infected with the isolate VE98MR and (2) an effective IC50 for pentamidine but nor for glucantime could be defined in monocytes infected with the isolate VE96ZC. On the contrary, an effective decrease in the percentage of infection susceptible to amphotericin-B was observed for all isolates and reference strains. The leishmanicidal effect did not correlate with significant increases in nitric oxide production. Conclusion: The human-amastigote macrophage model used constitutes a proof of concept to identify as potentially chemo-resistant isolates L. (L.) amazonensis (VE98MR) and L. (L.) mexicana (VE96ZC), but not L (L.) amazonensis (VE2000MM)(AU)

Fungal infection control by garlic extracts (Allium sativum L) and modulation of peritoneal macrophages activity in murine model of sporotrichosis / Controle da infecção fúngica pelos extratos de alho (Allium sativum L) e modulação da atividade de macrófagos peritoneais em modelo murino de esporotricose

Abstract Garlic (Allium sativum L.) is grown all over the world as seasoning and medicinal vegetable since 3,000 BC. Allicin is the main component of garlic, being attributed to it the most of its biological activities, such as bactericidal, antifungal and antiviral actions. However, other compounds of garlic present antioxidant, hypocholesterolemic, vasodilator activities, protective action against different types of cancer, and immunomodulatory. Fungal infections are important causes of morbidity and mortality in people mainly in immunosuppressed ones. Sporothrix schenckii, the causing agent of Sporotrichosis (most common subcutaneous mycosis in Latin America), is dimorphic fungus, of saprophytic life in soil or plants, infecting people and animals mainly through skin injuries and bruises. The main of this work was to evaluate the influence of garlic consuming on immune modulation of healthy and infected Swiss mice in induced way by S. schenckii, since these animals functioning of peritoneal macrophages as well as the nitric oxide and cytokines' production (IL-1β, IL-10 and IL-12) and to evaluate the antifungal potential of garlic with S. schenckii through minimum inhibitory concentration test and colony-forming units. The results showed that garlic offers antifungal potential with S. schenckii. The oral taking of garlic extracts influences the releasing of cytokines by macrophages, regular consuming shows anti-inflammatory effect, and its acute use may take to an inflammatory response. Mice that consumed garlic responded more effectively to fight against the infection.

Resumo O alho (Allium sativum L.) é cultivado em todo o mundo como hortaliça condimentar e medicinal desde 3.000 a. C. A alicina é o principal componente do alho, sendo atribuída a ela a maior parte das suas atividades biológicas, dentre elas as ações bactericida, antifúngica e antiviral. Porém, outros compostos do alho apresentam atividade antioxidante, hipocolesterolemiante, vasodilatadora, ação protetora contra diversos tipos de câncer e imunomoduladora. As infecções por fungos são causas importantes de morbidade e mortalidade no homem principalmente em indivíduos imunossuprimidos. O Sporothrix schenckii, agente causal da esporotricose (micose subcutânea mais comum na América Latina), é fungo dimórfico, de vida saprofítica no solo ou em vegetais, infectando homens e os animais principalmente através de lesões e arranhões na pele. O objetivo desse trabalho foi avaliar a influência do consumo de alho na imunomodulação de camundongos Swiss saudáveis e infectados de forma induzida por S. schenckii, a partir do estado funcional dos macrófagos peritoneais desses animais quanto à produção de óxido nítrico e das citocinas (IL-1β, IL-10 e IL-12) e avaliar o potencial antifúngico do alho frente ao S. schenckii por meio de teste de concentração inibitória mínima e unidades formadoras de colônia. Os resultados demonstraram que o alho apresenta potencial antifúngico frente S. schenckii. A administração oral de extratos de alho influencia a liberação de citocinas por macrófagos, o consumo regular apresenta efeito anti-inflamatório, e seu uso agudo pode gerar uma resposta inflamatória. Camundongos que consumiram alho responderam de forma mais efetiva no combate da infecção.

Chronic granulomatous inflammation in teleost fish Piaractus mesopotamicus: histopathology model study / Inflamación crónica granulomatosa en el pez teleósteo Piaractus mesopotamicus: modelo de estudio histopatológico

ABSTRACT Objective. This study evaluated the cell kinetic and formation of granuloma during chronic inflammation induced by Bacillus Calmette-Guérin (BCG) in the skeletal muscle of Piaractus mesopotamicus, as a histopathology model to study innate immunity. Materials and methods. Sixty fish were divided in two groups: BCG-inoculated and non-inoculated fish and the inflammatory response analyzed 3, 7, 14, 21 and 33 days post-inoculation (DPI) by histopathology after hematoxylin-eosin and Ziehl-Neelsen staining. Results. 3 DPI of BCG showed a diffuse inflammatory reaction mostly composed by mononuclear cells. The inflammation continued diffuse 7 DPI initiating the cellular organization surrounding the inoculum and have continued at 14 DPI with discrete presence of epithelioid-like type cells with acidophilic cytoplasm and floppy chromatin. Higher cellular organization (21 DPI) surrounding the granuloma with intense peripheral mononuclear inflammatory infiltrate and nevertheless, an increase in the number of fibroblasts and macrophage-like cells was observed. The inflammatory process became less diffuse 33 DPI with formation of small amount of granuloma surrounded by the same type of reaction found in bigger granuloma. Both the young and old granuloma presented typical characteristic around the inoculum composed by a layer of epithelioid-like type cells, besides macrophages, some lymphocytes and abundant fibroblasts. Conclusions. This study showed the feasibility in the use of pacus to study chronic granulomatous inflammatory response induced by BCG, characterized by changes in the kinetics of inflammatory cells in skeletal muscle classifying as immune-epithelioid type, similar to granulomatous inflammation caused by M. marinum in teleost fish.

RESUMEN Objetivo. Este estudio evaluó la cinética celular y la formación de granuloma durante la inflamación crónica inducida por el Bacilo Calmette-Guérin (BCG) en el músculo esquelético de Piaractus mesopotamicus, como modelo histopatológico para estudiar la inmunidad innata. Materiales y métodos. Sesenta peces fueron divididos en dos grupos: peces inoculados con BCG y no inoculados y la respuesta inflamatoria analizada en 3, 7, 14, 21 y 33 días post-inóculo (DPI) por medio del análisis histopatológico y tinciones de hematoxilina-eosina y Ziehl-Neelsen. Resultados. 3 DPI de BCG se observó reacción inflamatoria difusa principalmente formada por infiltrado celular mononuclear. Al 7° DPI la inflamación continuaba difusa con inicio de organización celular alrededor del inoculo, que se observó hasta el 14° DPI con discreta presencia de células de tipo epiteliodes con citoplasma acidófilo y cromatina laxa. Para el 21° DPI se observó alta organización celular alrededor del granuloma con intenso infiltrado mononuclear periférico e incremento en el número de fibroblastos y macrófagos. El proceso inflamatorio se tornó menos difuso a los 33 DPI con formación de pequeños granulomas contenidos dentro de uno más grande. Los granulomas formados más rápidamente así como los formados tardíamente, presentaron características típicas alrededor del inóculo compuesta por una camada de células tipo epitelioides, macrófagos, linfocitos y fibroblastos. Conclusiones. Este estudio mostró la viabilidad del uso del P. mesopotamicus para estudiar la respuesta inflamatoria crónica granulomatosa inducida con BCG, caracterizado por la evolución de la cinética de células inflamatorias en el músculo esquelético clasificándolo como de tipo inmune-epitelioide, similar a la inflamación granulomatosa causada por M. marinum en peces teleósteos.

Evaluation of cell damage and modulation of cytokines TNF-, IL-6 and IL-10 in macrophages exposed to PpIX-mediated photodynamic therapy

Abstract Little is known regarding whether photodynamic therapy (PDT)-induced cell death can substantially compromise macrophages (M), which are important cells in PDT-induced immune responses. Here, parameters of PDT-mediated M cytotoxicity and cytokine production in response to protoporphyrin IX (PpIX) were evaluated. Peritoneal M from BALB/c mice were stimulated in vitro with PDT, light, PpIX, or lipopolysaccharide (LPS). After that, cell viability, lipid peroxidation, Nitric Oxide (NO), DNA damage, TNF-, IL-6 and IL-10 were evaluated. Short PDT exposure reduced cell viability by 1030%. There was a two-fold increase in NO and DNA degradation, despite the non-increase in lipoperoxidation. PDT increased TNF- and IL-10, particularly in the presence of LPS, and decreased the production of IL-6 to 10-fold. PDT causes cellular stress, induces NO radicals and leads to DNA degradation, generating a cytotoxic microenvironment. Furthermore, PDT modulates pro- and anti-inflammatory cytokines in M.

Resumo Pouco se sabe se a morte celular induzida pela terapia fotodinâmica (PDT) compromete os macrófagos (M), envolvidos nas respostas imunes induzidas pela PDT. Neste estudo, foram avaliados parâmetros de citotoxicidade dos M mediada pela PDT e a produção de citocinas, frente à protoporfirina IX (PpIX). M peritoneais de camundongos BALB/c foram estimulados in vitro com PDT, luz, PpIX ou lipopolissacarídeo (LPS). Após isto, a viabilidade celular (VC), a lipoperoxidação, os níveis de óxido nítrico (NO), de DNA degradado, de TNF-, IL-6 e IL-10 foram avaliados. A exposição curta à PDT reduziu a VC em 10-30%. Os níveis de NO e de DNA degradado duplicaram, sem aumento da lipoperoxidação. Houve aumento de TNF- e IL-10, sendo maior na presença de LPS. Já a produção de IL-6 reduziu em dez vezes. A PDT induz estresse celular, gera radicais NO e causa dano ao DNA, tornando o microambiente citotóxico. Ainda, modula citocinas pró e anti-inflamatórias em M.

Participação dos receptores purinérgicos na ação estimulatória da crotoxina sobre a produção de espécies reativas do oxigênio por linhagem de monócito humano (THP-1) / Participation of purinergic receptors in the stimulatory action of crotoxin on the production of reactive oxygen species by human monocyte (THP1)

Crotoxin (CTX), the major toxin of Crotalus durissus terrificus snake venom, induces immunomodulatory action, particularly on the macrophages function, crucial cells to innate defense mechanisms. In these cells, dual action of this toxin is observed, since both inhibition of some functional parameters such as spreading and phagocytosis, as well as respiratory burst (hydrogen peroxide-H2O2 generation and nitric oxide-NO generation), Lipoxin A4 (LXA4) and its stable analog (15-Epi-LXA4) secretion and glucose and glutamine metabolism increased. Recent studies have demonstrated the importance of these CTX stimulatory actions on the metabolism of macrophages for the control of infectious inflammatory response and for tumor progression. Furthermore, FPRs are crucial for the different effects of CTX on macrophage function and metabolism. In spite of these evidences, the mechanisms involved with the CTX stimulatory actions on the metabolism of these cells are not known in their entirety. Among the mechanisms involved in the regulation of energetic metabolism of macrophages, purinergic signaling is essential in the stimulation of cytokine secretion and the reactive oxygen species and reactive nitrogen species generation by macrophages, besides being receptors responsive to stimuli via FPRs. Therefore, the objective of the present project was to investigate the possible participation of purinergic receptors on the H2O2 production by CTX treated THP-1 monocytic cells and whether FPRs participate in this signaling. For this purpose, THP-1 cells were used, such as monocytes or macrophage-differentiated or LPS-stimulated cells. The results show that THP-1 monocytes, such as macrophages differentiated from THP-1, by previous incubation with PMA, showed a significant increase of H2O2 production in the presence of different concentrations of CTX. CTX-induced H2O2 production increased was also observed after 24 hours by differentiated and LPS-stimulated macrophages. Different CTX concentrations lead to a significant increase in the ATP releasing by THP-1, in the absence or presence of LPS. Furthermore, different concentrations of CTX enhanced visualization of P2Y11 purinergic receptors and FPRs in LPS-stimulated THP-1. Blocking of P2X and P2Y purinergic receptors by non-selective antagonists abolished CTX-induced H2O2 production. Blocking of the FPRs by the selective antagonist partially interfered with the production of this toxin-induced reaction. The results together demonstrate, in an unprecedented way, that human monocytes are responsive to the action stimulatory CTX on ROS production and release of ATP and demonstrate for the first time that purinergic receptors are involved in this CTX-stimulatory action, with the FPRs participation.

A Crotoxina (CTX), toxina majoritária do veneno de serpente Crotalus durissus terrificus (VCdt) acarreta ação imunomoduladora, particularmente sobre a funcionalidade de macrófagos, células fundamentais para os mecanismos da defesa inata. Nestas células, é observado o dualismo na ação desta toxina, uma vez que foi observada tanto inibição de alguns parâmetros funcionais, como espraiamento e fagocitose, quanto à estimulação do “burst” respiratório (da geração de peróxido de hidrogênio-H2O2 e óxido nítrico-NO), da secreção de lipoxina A4 (LXA4) e seu análogo estável (15-Epi-LXA4) e do metabolismo de glicose e glutamina. Estudos recentes vêm demonstrando a importância dessas ações estimulatórias da CTX sobre o metabolismo de macrófagos para o controle da resposta inflamatória infecciosa e para a progressão tumoral. Ainda, receptores para peptídeo formil (Formyl Peptide Receptors-FPRs), ligantes de LXA4/15-Epi-LXA4 são cruciais para os diferentes efeitos da CTX sobre função e metabolismo de macrófagos. Apesar dessas evidencias não são conhecidos, na sua totalidade, os mecanismos envolvidos com as ações estimulatórias da CTX sobre o metabolismo destas células. Dentre os mecanismos envolvidos na regulação do metabolismo energético de macrófagos, a sinalização purinérgica é essencial na estimulação de secreção de citocinas e na geração de espécies reativas do oxigênio e do nitrogênio por macrófagos, além de serem receptores responsivos a estímulos via FPRs. Portanto, o objetivo do presente projeto foi investigar a possível participação dos receptores purinérgicos (RPs) sobre a produção de H2O2 por células monocíticas da linhagem THP-1, tratadas com CTX e se FPRs participam desta sinalização. Para tanto, foram utilizadas as células THP-1, como monócitos ou diferenciados em macrófagos ou estimulados por LPS. Os resultados mostram que os monócitos THP-1, como macrófagos diferenciados a partir de THP-1, por meio da incubação prévia com PMA, apresentaram aumento significativo da produção de H2O2 na presença das diferentes concentrações de CTX. O aumento da produção de H2O2 induzido pela CTX também foi observado após 24 horas, por macrófagos diferenciados e estimulados com LPS. Diferentes concentrações de CTX acarretam importante aumento de liberação de ATP por THP-1, na ausência ou presença de LPS. Ainda, as diferentes concentrações de CTX induziram aumento da visualização de receptores purinérgicos P2Y11 e FPRs em THP-1 estimuladas com LPS. O bloqueio dos receptores purinérgicos P2X e P2Y por antagonistas não seletivos aboliu a produção de H2O2 induzida pela CTX. O bloqueio dos FPRs pelo antagonista seletivo interferiu parcialmente com a produção deste reativo induzido pela toxina. Os resultados em conjunto demonstram, de maneira inédita, que monócitos humanos são responsivos à ação estimulatória da CTX sobre a produção de ROS e liberação de ATP e demonstram, pela primeira vez, que receptores purinérgicos estão envolvidos nesta ação estimulatória da CTX, com a participação dos FPRs.

Efeitos do fragmento variável de cadeia única anti-LDL eletronegativa vetorizado em nanocápsulas na aterosclerose experimental / Effects of an anti-LDL(-) single chain fragment variable vectorized in nanocapsules in experimental atherosclerosis

As doenças cardiovasculares são a principal causa de mortalidade no mundo. A aterosclerose é a base fisiopatológica dessas doenças, sendo definida como um processo crônico-inflamatório multifatorial, resultando da interação de diferentes células como linfócitos, macrófagos, células endoteliais e células musculares lisas na parede arterial. A lipoproteína de baixa densidade eletronegativa [LDL(-)], uma subfração modificada da LDL nativa, desempenha um papel-chave na aterosclerose, uma vez que as modificações sofridas por esta partícula são capazes de induzir o acúmulo de ésteres de colesterol em macrófagos e a subsequente formação de células espumosas. O sistema imunológico é crucial no processo aterogênico e estratégias terapêuticas direcionadas à imunoregulação deste processo têm sido utilizadas como novas alternativas tanto na prevenção do desenvolvimento quanto da progressão desta doença. Dentre essas estratégias, destaca-se o uso de fragmentos de anticorpos como o scFv (do inglês, single chain fragment variable), que podem ainda estar conjugados a nanopartículas com o intuito de aumentar sua eficiência de ação no organismo. Diante do papel da LDL(-) na aterosclerose, este projeto objetivou avaliar os efeitos in vitro e in vivo de um sistema nanoestruturado contendo fragmentos scFv anti-LDL(-) derivatizados na superfície de nanocápsulas sobre macrófagos murinos e humanos primários e em camundongos knockout para o gene do receptor da LDL (Ldlr-/-) no desenvolvimento e na progressão dessa doença. Demonstrou-se que o tratamento de macrófagos com a formulação scFv anti-LDL(-)-MCMN-Zn diminuiu de forma significativa a captação de LDL(-), assim como a expressão de IL-1ß (mRNA e proteína) e MCP-1 (mRNA). Foi demonstrada a internalização da nanoformulação pelos macrófagos via diferentes mecanismos de endocitose, demonstrando seu potencial uso como carreador de fármacos. In vivo, a nanoformulação diminuiu de forma significativa a área da lesão aterosclerótica em camundongos Ldlr-/- submetidos à avaliação pela técnica de tomografia por emissão de pósitrons (do inglês, PET), utilizando o radiotraçador 18F-FDG (18F-desoxiglicose), associada à tomografia computadorizada (CT) com agente de contraste iodado, além da análise morfométrica das lesões no arco aórtico. O conjunto dos resultados obtidos evidenciou a ação ateroprotetora da formulação scFv anti-LDL(-)-MCMN-Zn, reforçando seu potencial como estratégia terapêutica na aterosclerose

Cardiovascular diseases are the leading cause of mortality worldwide. Atherosclerosis is the pathophysiological basis of these diseases, defined as a chronic inflammatory multifactorial process, resulting from the interaction of several cells such as lymphocytes macrophages, endothelial cells and smooth muscle cells within the arterial wall. The electronegative low-density lipoprotein [LDL(-)], a modified subfraction of native LDL, plays a key role in atherosclerosis, since its modifications are capable of inducing the accumulation of cholesteryl esters in macrophages and the subsequent foam cells formation. The immune system is crucial in atherogenic process and therapeutic strategies directed to the immunoregulation of this process have been used as a new alternative in the prevention of the development as well as the progression of this disease. Among these strategies, it is the use of antibody fragments such as scFv (single chain fragment variable), which may be also conjugated to nanoparticles in order to increase their efficiency in the body. Given the role of LDL(-) in atherosclerosis, the aim of this project was to evaluate the in vitro and in vivo effects of a nanostructured system containing scFv anti-LDL(-) fragments derivatized on the surface of nanocapsules on murine and human primary macrophages and in the development and progression of the disease in LDL receptor knockout mice (Ldlr-/-). It was demonstrated that the treatment of macrophages with scFv anti-LDL(-)-MCMN-Zn formulation significantly decreases the uptake of LDL(-) and the expression IL-1ß (mRNA and protein) and MCP-1 (mRNA). Moreover, the internalization of the nanoformulation by macrophages through different endocytosis mechanisms was shown, demonstrating its potential use as a nanocarrier. In vivo, the nanoformulation decreased the area of atherosclerotic lesions in Ldlr-/- mice evaluated by positron emission tomography with 18F-FDG associated with computed tomography with iodinated contrast agent (PET/CT), besides the lesion morphometric analysis at the aortic arch Thus, these data provide evidence of the atheroprotection action of the ateroprotection action of the scFv anti-LDL(-)-MCMN-Zn formulation, suggesting its promising use as a therapeutic strategy for atherosclerosis

Pectinas de plantas medicinais: características estruturais e atividades imunomoduladoras / Pectins of medicinal plants: structural characteristics and immunomodulatory activities

RESUMO As plantas medicinais apresentam várias propriedades terapêuticas, as quais estão relacionadas com a presença de compostos bioativos. Dentre os compostos, destacam-se as pectinas, que compreendem um grupo de polissacarídeos ácidos de relevante importância medicinal e nutracêutica. As pectinas são formadas por unidades de ácido galacturônico, unidas por ligação do tipo α-(1→4), sendo classificadas em homogalacturonanas e ramnogalacturonanas tipo I (RG-I) e tipo II (RG-II). Outros polissacarídeos constituídos por arabinose e/ou galactose têm sido isolados em associação com polissacarídeos pécticos, como as arabinogalactanas (AG) (tipo I e tipo II). As AG-II podem estar associadas a proteínas, denominadas de arabinogalactana-proteínas (AGPs). Inúmeros relatos demonstram que as pectinas, bem como as AG e AGPs, podem atuar como moduladores do sistema imunológico, sendo, por isso, consideradas modificadores da resposta biológica. A imunomodulação pode estar relacionada tanto com a atividade de macrófagos quanto com as vias do sistema complemento. Em geral, os polissacarídeos provocam um estímulo da atividade fagocitária; no aumento da produção de espécies reativas de oxigênio e da secreção de citocinas pró-inflamatórias. Em relação ao sistema complemento, os polissacarídeos podem modular tanto a via clássica como a via alternativa. A presente revisão tem como objetivo principal descrever os aspectos estruturais de pectinas e suas atividades biológicas relacionadas à modulação do sistema imune. Utilizando literatura específica, estão descritas informações de 29 espécies de plantas medicinais, que apresentam como constituintes pectinas, arabinogalactanas e/ou AGPs, correlacionando suas propriedades terapêuticas com as atividades biológicas associadas ao sistema imune. Na maioria dos casos descritos na literatura, é difícil determinar como as características estruturais específicas podem estar envolvidas na modulação da atividade de macrófagos. Porém, em relação à modulação da atividade do sistema complemento fica sugerido que a presença de estruturas tipo AG-II contribuiria mais significativamente para esta atividade. Entretanto, os possíveis mecanismos de modulação de pectinas, AGs e AGPs sobre a atividade de macrófagos e/ou sobre o sistema complemento ainda não estão totalmente esclarecidos, mesmo assim, estes polímeros podem ser considerados potenciais candidatos para estudos que visam ao desenvolvimento de novos agentes terapêuticos com propriedades moduladoras benéficas para o sistema imunológico.

ABSTRACT Medicinal plants have many therapeutic properties that are related to the presence of biologically active compounds. Pectins, a group of acid polysaccharides that have relevant medicinal and nutraceutical properties, are an example of such biological compounds. Pectins contain a main chain with galacturonic acid units that are α-(1→4) linked; they can be classified into homogalacturonans and type I and type II rhamnogalacturonans (RG-I and RG-II). Other polysaccharides containing arabinose, galactose, or both have been isolated in association with pectin-type polysaccharides are known as arabinogalactans (AGs, type I and type II). Arabinogalactan-proteins (AGPs) comprise AG-II associated with proteins. Several studies have reported that pectins, as well as AG and AGPs, can act as modulators of the immune system and can therefore be considered biological response modifiers. The immunomodulation is related to the activity of macrophages as on the complement system pathways. In general, polysaccharides cause stimulation of phagocytic activity, increase production of reactive oxygen species and secretion of pro-inflammatory cytokines. Polysaccharides can modulate the classical and alternative complement pathways. The aim of this review has to describe the structural aspects of pectins and their biological activities related to the modulation of the immune system. Using literature, we reported data of 29 medicinal plant species, which present as constituents pectins, arabinogalactan and/or AGPs, correlating their therapeutic properties with biological activities associated to the immune system. In most cases described in the literature, it is difficult to determine how the specific structural characteristics can be involved in modulation of macrophage activity. However, with respect to the modulation of the activity of the complement system is proposed that the presence of AG-II-type structures would contribute most significantly to this activity. The possible mechanisms of modulation of pectins, AGs and AGPs on macrophage activity and/or the complement system are not yet fully clear, even if, these polymers can be considered potential candidates for studies aimed at the development of new therapeutic agents with modulatory properties beneficial to the immune system.